Ⅰ. Zasada technologii PCR
W tym roku COVID-19 szaleje na całym świecie i wszyscy musieli słyszeć o testowaniu kwasu nukleinowego. W wykrywaniu epidemii kwasu nukleinowego technologia fluorescencji PCR odgrywa kluczową rolę, która może pomóc inspektorom szybko i dokładnie określić, czy są zakażeni COVID-19.
Czym dokładnie jest technologia PCR?
PCR jest akronimem reakcji łańcuchowej polimerazy. W skrócie, PCR składa się z trzech podstawowych etapów reakcji: denaturacja w wysokiej temperaturze-wyżarzanie w niskiej temperaturze-wydłużenie w średniej temperaturze:
1. Denaturacja DNA, aby stać się jednoniciowym
Po podgrzaniu szablonu DNA do około 95 ° C przez pewien okres czasu, podwójna nić matrycowego DNA jest dysocjowana na jednoniciową, aby mogła związać się ze starterem i przygotować się do następnej rundy reakcji.
2. wyżarzanie w niskiej temperaturze
Po denaturacji matrycowego DNA w pojedyncze nici, temperaturę obniża się do około 55 ° C, a startery są łączone z komplementarnymi sekwencjami pojedynczych nici matrycowego DNA.
3. Rozszerzenie średniej temperatury
Pod działaniem enzymu Taq, koniugaty matrycy DNA i startera wykorzystują dNTP jako surowiec reakcji, a sekwencję docelową jako szablon, zgodnie z zasadą parowania zasad i replikacji półzarezerwowanej, a w końcu zsyntetyzować nowy półzarezerwowany łańcuch replikacyjny komplementarny do łańcucha matrycy DNA.
Tak. Metody wykrywania fluorescencyjnego PCR
Obecnie większość odczynników do wykrywania COVID-19 zatwierdzonych przez Państwową Administrację Leków w Chinach wykorzystuje fluorescencyjne metody PCR do wykrywania COVID-19.
Metoda fluorescencyjnego PCR odnosi się do dodawania grup fluorescencyjnych do systemu reakcji PCR. Wraz z postępem amplifikacji PCR produkty reakcji nadal się kumulują, a intensywność sygnału fluorescencji również wzrasta proporcjonalnie. Wykres krzywej amplifikacji fluorescencji, wykrywanie w czasie rzeczywistym procesu fluorescencji PCR.
Ⅲ. Zasady wyboru materiałów eksploatacyjnych fluorescencyjnych PCR
1. Materiał
PCR jest zwykle wykonany z materiału PP, ponieważ materiały eksploatacyjne PCR/qPCR są zwykle w bezpośrednim kontakcie z odczynnikami lub próbkami, podczas gdy materiał polipropylenowy (PP) jest materiałem biologicznie obojętnym, powierzchnia nie jest łatwa do przylegania do biomolekuł i ma dobrą odporność chemiczną i temperaturę. Tolerancja (może być autoklawizowana w temperaturze 121 ° C i może również wytrzymać zmiany temperatury podczas cyklu termicznego). Wszystkie materiały eksploatacyjne PCR są materiałem PP.
2. Objętość rurki/płytki PCR
Jak wybrać rurki/płytki PCR o różnych objętościach?
Cel wyboru: wybierz odpowiedni produkt zgodnie z konkretnymi wymaganiami eksperymentalnymi. Objętość probówek PCR może w większości spełniać wymagania reakcji PCR. Rurki PCR są idealne do eksperymentów PCR/qPCR o niskiej lub średniej przepustowości, przy czym pojedyncze rurki i paski są dwoma najczęściej stosowanymi formatami.
Pojedyncza rurka zapewnia elastyczność w ustawianiu dokładnej liczby reakcji do uruchomienia. Alternatywnie można wybrać pojedynczą rurkę 0,5 ml dla większych objętości reakcji.
Łączniki są zwykle dostępne w formacie 8 lub 12 rur z oddzielnymi lub z kołpakami. Kompatybilny z pipetami jedno-i wielokanałowymi do eksperymentów o niskiej i średniej przepustowości. Paski z nakrętkami otwierają i zamykają rurki z próbkami niezależnie, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbki.
3. Grubość ścianki
Grubość ścianki rury wpływa bezpośrednio na przewodność cieplną, a wyjątkowo cienkie grubości ścianek optymalizują przenoszenie ciepła i skracają czas cyklu. Ultracienkościenne tworzywo sztuczne jest o około 50% cieńsze niż wersja standardowa, co dodatkowo zmniejsza barierę termiczną, co skutkuje szybszą i bardziej niezawodną reakcją. Wszystkie materiały eksploatacyjne PCR to ultracienkie ściany rurowe.
4. Kolor
Płytki PCR są często dostępne w różnych formatach kolorów, aby ułatwić wizualne różnicowanie i identyfikację próbek, szczególnie w eksperymentach o wysokiej przepustowości. W przypadku zwykłych reakcji PCR możliwe jest stosowanie przezroczystych lub kolorowych probówek PCR, a przezroczyste rurki PCR są bardziej pomocne w zarządzaniu klasyfikacją próbek.
Chociaż kolor plastiku nie ma wpływu na amplifikację DNA, do qPCR zalecane są wysokiej jakości białe materiały eksploatacyjne PCR. Ponieważ qPCR wymaga ilościowego wykrywania intensywności sygnału fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym, wymagana jest czuła i dokładna transmisja sygnału fluorescencyjnego. Eksperymenty wykazały, że w porównaniu z tradycyjnymi przezroczystymi produktami PCR, białe produkty PCR mogą w największym stopniu odzwierciedlać sygnał fluorescencyjny, zmniejszyć zanieczyszczenie krzyżowe sygnałów kosmicznych, i uzyskać wyniki ilościowej PCR fluorescencji w czasie rzeczywistym.
Różne marki instrumentów, ze względu na różne położenie detektora fluorescencji, proszę zapoznać się z materiałami zalecanymi przez producenta. W przypadku instrumentu PCR Bio-Rad CFX lub Roche 480 w czasie rzeczywistym producent zaleca stosowanie białych płytek PCR. Ponieważ płytka PCR jest biała lub przezroczysta i ma różne specyfikacje, nadaje się do popularnych instrumentów PCR na rynku.
Wyślij do nas e-mail: