Aktualności

1. w czasie rzeczywistym ilościowe PCR

W 1996 r. Stosowana Biosystems w Stanach Zjednoczonych wprowadziła po raz pierwszy ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR w czasie rzeczywistym). Tak zwany qPCR w czasie rzeczywistym odnosi się do dodawania grup fluorescencyjnych do reakcji PCR w celu ciągłego monitorowania sygnału fluorescencyjnego. Kolejność pojawiania się i zmiana siły sygnału może posłużyć do analizy początkowej ilości docelowego genu w czasie rzeczywistym. Wynalazek tej technologii realizuje skok od jakościowej do ilościowej PCR.

2. chemikalia stosowane w fluorescencji PCR

Obecnie qPCR w czasie rzeczywistym dzieli się na dwie kategorie: barwniki fluorescencyjne i sondy fluorescencyjne zgodnie z różnymi stosowanymi chemikaliami fluorescencyjnymi.

3. Barwniki stosowane w fluorescencji PCR

Barwniki fluorescencyjne są również nazywane barwnikami wiążącymi DNA. Obecnie używaną główną cząsteczką barwnika jest SYBR Green I. SYBR Green I może specyficznie wiązać się z mniejszym rowkiem dwuniciowego DNA. Wolny SYBR Green I prawie nie ma sygnału fluorescencyjnego, ale wiąże się z dwuniciowym DNA. Następnie jego sygnał fluorescencji można zwiększyć setki razy. Wraz ze wzrostem produktu PCR wzrasta również ilość wiązania produktu PCR i barwnika, a intensywność sygnału fluorescencji reprezentuje liczbę dwuniciowych cząsteczek DNA.

Zaletami barwników fluorescencyjnych jest to, że są łatwe w użyciu, można je łączyć z dowolnym produktem PCR i są niedrogie.

Ogólnie rzecz biorąc, metoda SYBR Green I jest jednym z najbardziej podstawowych i powszechnie stosowanych eksperymentów qPCR w czasie rzeczywistym.

4. Sondy do fluorescencji PCR

The most commonly used fluorescent probes in Real-time qPCR are TaqMan probes. The basic principle is to design and synthesize a probe that can specifically hybridize to the target gene. The 5' end of the probe is labeled with a fluorophore, and the 3' end is labeled with a quencher group.

W normalnych warunkach odległość przestrzenna między dwiema grupami jest bardzo bliska, a gen fluorescencyjny nie może fluoryzować z powodu gaszenia. Podczas amplifikacji PCR spłonka i sonda wiążą się jednocześnie z matrycą, a pozycja wiązania sondy znajduje się pomiędzy starmerami w górę i w dół.

When the amplification extends to the position where the probe binds, the Taq enzyme uses the 5' exonuclease activity to cleave the fluorescent molecule attached to the 5' end of the probe from the probe, causing it to fluoresce. The number of detected fluorescent molecules is proportional to the number of PCR products, therefore, the number of initial DNA templates can be calculated according to the fluorescence intensity in the PCR reaction system.

Technologia sondy TaqMan rozwiązuje problem połączenia barwników fluorescencyjnych i niespecyficznego wzmocnienia. Po reakcji nie ma potrzeby wykrywania krzywej topnienia, co skraca czas testu.

Zalety technologii sondy TaqMan to niskie tło fluorescencji, wysoka czułość, wysoka stabilność hybrydyzacji, dobra rozdzielczość widmowa fluorescencji i wysoka specyficzność.

Ze względu na wysoką specyficzność sond TaqMan może być stosowany do dyskryminacji allelicznej, zwłaszcza do polimorfizmów genów ludzkich oraz do rozróżniania i ilościowego określania szczepów na podstawie SNP.