1. w czasie rzeczywistym ilościowe PCR
W 1996 r. Stosowana Biosystems w Stanach Zjednoczonych wprowadziła po raz pierwszy ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR w czasie rzeczywistym). Tak zwany qPCR w czasie rzeczywistym odnosi się do dodawania grup fluorescencyjnych do reakcji PCR w celu ciągłego monitorowania sygnału fluorescencyjnego. Kolejność pojawiania się i zmiana siły sygnału może posłużyć do analizy początkowej ilości docelowego genu w czasie rzeczywistym. Wynalazek tej technologii realizuje skok od jakościowej do ilościowej PCR.
2. chemikalia stosowane w fluorescencji PCR
Obecnie qPCR w czasie rzeczywistym dzieli się na dwie kategorie: barwniki fluorescencyjne i sondy fluorescencyjne zgodnie z różnymi stosowanymi chemikaliami fluorescencyjnymi.
3. Barwniki stosowane w fluorescencji PCR
Barwniki fluorescencyjne są również nazywane barwnikami wiążącymi DNA. Obecnie używaną główną cząsteczką barwnika jest SYBR Green I. SYBR Green I może specyficznie wiązać się z mniejszym rowkiem dwuniciowego DNA. Wolny SYBR Green I prawie nie ma sygnału fluorescencyjnego, ale wiąże się z dwuniciowym DNA. Następnie jego sygnał fluorescencji można zwiększyć setki razy. Wraz ze wzrostem produktu PCR wzrasta również ilość wiązania produktu PCR i barwnika, a intensywność sygnału fluorescencji reprezentuje liczbę dwuniciowych cząsteczek DNA.
Zaletami barwników fluorescencyjnych jest to, że są łatwe w użyciu, można je łączyć z dowolnym produktem PCR i są niedrogie.
Ogólnie rzecz biorąc, metoda SYBR Green I jest jednym z najbardziej podstawowych i powszechnie stosowanych eksperymentów qPCR w czasie rzeczywistym.
4. Sondy do fluorescencji PCR
Najczęściej stosowanymi sondami fluorescencyjnymi w qPCR czasu rzeczywistego są sondy TaqMan. Podstawową zasadą jest zaprojektowanie i zsyntetyzowanie sondy, która może specyficznie hybrydyzować z genem docelowym. Koniec 5 'sondy jest oznaczony fluoroforem, a koniec 3 'jest oznaczony grupą gaszącą.
W normalnych warunkach odległość przestrzenna między dwiema grupami jest bardzo bliska, a gen fluorescencyjny nie może fluoryzować z powodu gaszenia. Podczas amplifikacji PCR spłonka i sonda wiążą się z szablonem w tym samym czasie, a pozycja wiązania sondy znajduje się pomiędzy starterami w górę i w dół.
Kiedy amplifikacja rozciąga się do pozycji, w której sonda się wiąże, enzym Taq wykorzystuje aktywność egzonukleazy 5 'do rozszczepienia cząsteczki fluorescencyjnej przyłączonej do końca 5 'sondy z sondy, powodując fluoryzowanie. Liczba wykrytych cząsteczek fluorescencyjnych jest proporcjonalna do liczby produktów PCR, dlatego liczbę początkowych szablonów DNA można obliczyć zgodnie z intensywnością fluorescencji w układzie reakcji PCR.
Technologia sondy TaqMan rozwiązuje problem połączenia barwników fluorescencyjnych i niespecyficznego wzmocnienia. Po reakcji nie ma potrzeby wykrywania krzywej topnienia, co skraca czas testu.
Zalety technologii sondy TaqMan to niskie tło fluorescencji, wysoka czułość, wysoka stabilność hybrydyzacji, dobra rozdzielczość widmowa fluorescencji i wysoka specyficzność.
Ze względu na wysoką specyficzność sond TaqMan może być stosowany do dyskryminacji allelicznej, zwłaszcza do polimorfizmów genów ludzkich oraz do rozróżniania i ilościowego określania szczepów na podstawie SNP.
Wyślij do nas e-mail: